Mertz et al 2010

*BioAssay 5:3 (2010)*	ISSN: 1809-8460
CONTROLE BIOLÓGICO

Efeito de Produtos Fitossanitários Naturais Sobre Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. in vitro Natalia Ramos Mertz¹, Luís F. Angeli Alves², Angelina M Marcomini³, Daian G. Pinto de Oliveira³, Juliana C. dos Santos⁴ ¹Universidade Federal de Lavras – UFLA; Depto. de Entomologia, Lab. de Conservação de Inimigos Naturais, CP 3037, 37200-000, Lavras, MG, nataliamertz@bol.com.br; ²Universidade Estadual do Oeste do Paraná – UNIOESTE; CCBS, Lab. de Zoologia de Invertebrados; Rua Universitária, 2069, CP 711, J. Universitário, 85814-110, Cascavel, lfaalves@unioeste.br; ³Universidade de São Paulo, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Depto. de Entomologia e Acarologia, Av. Pádua Dias, 11, CP 9, 13418-900, Piracicaba, SP, marcomin@esalq.usp.br; dgpdoliv@esalq.usp.br; ⁴Universidade Federal de Viçosa, Depto. de Biologia Animal; Lab. de Manejo Integrado de Pragas de Grãos Armazenados, Rua Cristovão Longuinho Santana, 135, 36570-000, Viçosa, MG, ciencias_biologicas@hotmail.com Enviado em: 21/IX/2008 Aceito em: 29/IV/2009; Publicado em: 07/XII/2010 Effect of Natural Phytosanitary Products on Beauveria bassiana (Bals.) Vuill. in vitro ABSTRACT - The associated use of natural products with entomopathogenic fungi can be an efficient strategy to pest and disease control and to reduce the environmental impacts, however, these products can act adversely against the fungi, affecting its vegetative growth, conidiogenesis, viability and pathogenicity. In view of the above, were evaluated the in vitro effects of the commercial products Agro-mos^®, Ecolife^® and Dalneem^® (concentrations 0.25; 0.5; 1; 2 and 4%) and the plant extracts of Curcuma longa (Zingiberaceae), Cymbopogon citratus and Cymbopogon nardus (Poaceae) (1; 5; 10; 15 e 20%) against Beauveria bassiana, which were mixed in a Potato Dextrose Agar (PDA) medium, into Petri dishes. Were verified the micelial growth, the conidiogenesis and the conidia viability, besides the fungi pathogenicity, when produced in contact with these products, against Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae) caterpillars. The commercial products affected all the parameters, being toxic in all concentrations and the plant extracts reduced the viability in at least 50% when compared to the control. Curcuma longa was compatible to fungi in the 1% concentration, Cymbopogon citratus was compatible until 15% and Cymbopogon nardus until 10% and all of them did not affect the fungi virulency. The results prove the necessity of such studies in order to do not affect the action of biological control agents. Key words - compatibility, entomopathogenic fungi, plant extracts, Curcuma longa, Cymbopogon spp. RESUMO - A utilização conjunta de produtos de origem natural com fungos entomopatogênicos pode ser uma estratégia eficiente para o controle de pragas e doenças e reduzir danos ambientais. Contudo, estes produtos podem atuar negativamente sobre o fungo, afetando o seu crescimento vegetativo, produtividade e germinação de conídios, e até sua virulência. Com isso, foram avaliados in vitro os efeitos dos produtos comerciais Agro-mos^®, Ecolife^® e Dalneem^® (concentrações 0,25; 0,5; 1; 2 e 4%) e dos extratos das plantas cúrcuma (Curcuma longa) (Zingiberaceae), capim-limão (Poaceae) (Cymbopogon citratus) e citronela (Cymbopogon nardus) (1; 5; 10; 15 e 20%) sobre Beauveria bassiana, sendo os produtos e extratos adicionados ao meio Batata Dextrose Agar (BDA), em placas de Petri. Foram avaliados o crescimento vegetativo, produtividade e germinação de conídios e a virulência do fungo produzido em contato com os produtos, contra lagartas de Galleria mellonella (Lepidoptera: Pyralidae). Os produtos comerciais afetaram todos os parâmetros, sendo tóxicos em todas as concentrações e os extratos de plantas reduziram a viabilidade em, no mínimo, 50% comparado à testemunha. A cúrcuma foi compatível ao fungo na menor concentração, sendo o capim limão compatível até 15% e a citronela até 10%, e ambos não afetaram a virulência do fungo. Os resultados comprovam a necessidade de estudos dessa natureza de forma a não comprometer a ação de agentes de controle biológico. Palavras-chave - compatibilidade, fungo entomopatogênico, extratos vegetais, Curcuma longa, Cymbopogon spp. No Brasil, o aumento da produtividade agrícola nos sistemas de cultivo convencional se deve, principalmente, a utilização de produtos agrotóxicos e fertilizantes químicos sintéticos. Porém, a intensiva utilização e a aplicação inadequada desses produtos vêm causando problemas ambientais, tais como a seleção de fitopatógenos, plantas invasoras e de insetos-praga resistentes (Keinath 1998, Diez-Rodríguez & Omoto 2001, Branco et al. 2003, Roman et al. 2004), além do empobrecimento do solo e danos à saúde dos produtores e consumidores. A ocorrência desses problemas e a crescente exigência do mercado por produtos “ambientalmente corretos” têm feito muitos agricultores adotarem alternativas naturais e menos nocivas ao meio ambiente para o controle de doenças e pragas (Agrianual 2001). Dentre as alternativas para o controle de fungos fitopatogênicos, estão a utilização de extratos vegetais, como cúrcuma (Curcuma longa Linn.) (Zingiberaceae) (Saju et al. 1998, Singh & Rai 2000), capim-limão (Cymbopogon citratus Stapf.) (Fiori et al. 2000, Souza et al. 2002) e citronela (C. nardus Watson) (Poaceae) (Anthony et al. 2004). Além de produtos comerciais naturais compostos por extratos cítricos ou microrganismos, que podem ativar os mecanismos de defesa nas plantas tratadas ou possuir atividade antimicrobiana direta (Stangarlin et al. 1999, Cavalcanti et al. 2006, Santos et al. 2007). Para o controle alternativo de insetos-praga, destacam-se as plantas da família Meliaceae, como o nim (Azadirachta indica A. Juss.), cujo extrato possui ação inseticida comprovada sobre pragas como Bemisia tabaci Gennadius (Hemiptera: Aleyrodidae) (Souza & Vendramin 2000), Tuta absoluta Meyrick (Lepidoptera: Gelechiidae) (Trindade et al. 2000) e Spodoptera frugiperda Smith (Lepidoptera: Noctuidae) (Prates et al. 2003). Os fungos entomopatogênicos possuem também grande importância para o controle populacional de pragas, com destaque para Beauveria bassiana Bals. Vuil., o qual tem se mostrado eficiente para diversas pragas agrícola, como Bemisia tabaci Genn. (Hemiptera: Aleyrodidae) (Vicentini et al. 2001), os ácaros Tetranychus urticae Koch (Acari: Tetranychidae) (Tamai et al. 1999) e Oligonychus yothersi McGregor (Acari: Tetranychidae) (Oliveira et al. 2002), Hypothenemus hampei Ferrari (Coleoptera: Scolytidae) (Neves & Hirose 2005) e Diatraea saccharalis Fabricius (Lepidoptera: Crambidae) (Oliveira et al. 2008). Todas estas alternativas não químicas para o controle de pragas e doenças têm papel importante no Manejo Integrado de Pragas (MIP). No entanto, os produtos fitossanitários naturais devem ser seletivos tanto aos fungos entomopatogênicos que ocorrem naturalmente, quanto aos que são introduzidos, a fim de conservar sua viabilidade para o controle de insetos (Hirose et al. 2001, Oliveira et al. 2003). Nesse sentido, os estudos acerca da compatibilidade entre produtos fitossanitários e fungos entomopatogênicos passam a ser de grande importância em MIP (Silva & Neves 2005). Contudo, poucos estudos visam avaliar as alterações em diferentes variáveis de desenvolvimento de entomopatógenos, causadas pela utilização conjunta destes com produtos naturais, mesmo esta sendo uma prática de interesse dos produtores que visam o controle eficiente das pragas e doenças com o mínimo impacto ambiental. Assim, este trabalho teve por objetivo estudar, o efeito de produtos fitossanitários naturais, comerciais ou não, sobre o desenvolvimento do fungo entomopatogênico B. bassiana em condições de laboratório. Material e Métodos O fungo utilizado foi o isolado Unioeste 4 de B. bassiana (isolado de Alphitobius diaperinus Panzer, Coleoptera: Tenebrionidae), obtido no banco de patógenos do Laboratório de Zoologia de Invertebrados da UNIOESTE, cultivado pelo método de placa cheia em meio de esporulação (M.E.) e incubado por oito dias em câmara climatizada (26 ± 1°Ce 12h de fotofase) (Alves et al. 1998b). Após este período, o fungo foi recolhido e transferido para um tubo de vidro, onde se adicionaram 10 mL de água destilada estéril com espalhante adesivo Tween^® 80 (0,01%) para que fosse realizada a quantificação em câmara de Neubauer e padronização da concentração de conídios (Alves & Moraes 1998). Os tratamentos com as diferentes concentrações de produtos comerciais e extratos de plantas, utilizados como indutores de crescimento, inseticidas, fungicidas e/ou repelentes naturais estão expressos na Tabela 1. Preparação dos meios de cultura. Os produtos comerciais foram adicionados em diferentes proporções (0,25; 0,5; 1; 2 e 4%) ao meio de cultura BDA (batata, ágar e dextrose) estéril não solidificado (45-50ºC), em frascos de vidro, sendo agitados para homogeneização dos componentes. Em seguida, adicionou-se o antibiótico sulfato de estreptomicina (0,1%) e então os meios foram vertidos nas placas de Petri. Cada tratamento constou de quatro repetições, contendo uma placa cada repetição. As folhas das diferentes plantas foram trituradas juntamente com o caldo de batata, na quantidade em gramas necessária para se obter as diferentes concentrações (1; 5; 10; 15; e 20%). O líquido foi filtrado e a ele adicionaram-se a glicose e o ágar, que foram homogeneizados e, em seguida, esterilizados. Posteriormente, adicionou-se sulfato de estreptomicina (0,1%) e verteu-se o meio, como descrito anteriormente. Para a testemunha foram preparadas placas de Petri contendo apenas meio de cultura BDA. Crescimento vegetativo e produção de conídios. Em todos os tratamentos realizou-se o mesmo procedimento, sendo inoculados, no centro de cada placa, 50µL de suspensão contendo 5×10⁷ conídios de B. bassiana. As placas foram incubadas a 26 ± 1^oC e 12 h de fotofase, por oito dias. Para a avaliação de crescimento vegetativo foram realizadas duas medições perpendiculares na área onde o fungo cresceu, obtendo-se o diâmetro médio das colônias dos tratamentos. Para a estimativa da produção de conídios, as colônias foram recortadas e cada uma foi transferida para um tubo de vidro contendo 10 mL de água destilada esterilizada com espalhante adesivo Tween^® 80 (0,01%). Os conídios foram removidos por agitação durante 1 minuto. A suspensão obtida foi subseqüentemente diluída e quantificada em câmara de Neubauer. Os dados obtidos nas avaliações destes parâmetros foram submetidos ao cálculo compatibilidade, de acordo com a fórmula proposta por Alves et al. (1998a) para classificação do efeito de produtos químicos sobre fungos entomopatogênicos em testes in vitro, onde: VG = crescimento vegetativo e ESP = esporulação. Para valores de T entre 0 e 30, a classificação é muito tóxico; entre 31 a 45, tóxico; 46 a 60, moderadamente tóxico e maiores que 60, compatível. Germinação de conídios. O meio com os diferentes tratamentos foi vertido em placas de plástico de 9 cm de diâmetro e, depois do resfriamento e solidificação, foram espalhados 50µL de suspensão fúngica contendo 5×10⁷ conídios, pelo método de placa cheia. As placas foram incubadas por 16h a 26 ± 1^oC e 12 h de fotofase. Após este período, contou-se, dentre 500 conídios por placa, o número de conídios germinados e não-germinados, sob microscópio óptico (400×). Teste de patogenicidade. Para este teste, utilizaram-se apenas os tratamentos que foram considerados compatíveis com o fungo pelo cálculo de compatibilidade. Conídios do fungo foram inoculados pelo método de placa cheia nas placas de Petri contendo o meio BDA com os tratamentos. Após oito dias de incubação (a 26 ± 1^oC e 12 h de fotofase), os conídios foram recolhidos e transferidos para tubos de vidro contendo 10 mL de água destilada esterilizada com espalhante adesivo Tween^® 80 (0,01%). As suspensões obtidas foram homogeneizadas, diluídas, quantificadas em câmara de Neubauer, e padronizadas em concentrações de 1×10⁸ conídios/mL. Lagartas de 5^o ínstar de Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Pyralidae) foram utilizadas como inseto-teste, colocadas em recipientes plásticos descartáveis onde foram imersas em 1 mL de suspensão de conídios, sendo agitados manualmente por 30 segundos. Na testemunha, as lagartas foram imersas em solução aquosa de espalhante adesivo Tween^® 80 (0,01%). Em seguida, os insetos foram transferidos para placas de Petri contendo papel filtro e dieta. As placas foram colocadas em recipientes plásticos contendo algodão umedecido, e estes mantidos em 26 ± 1°C e 14h de fotofase. Cada tratamento consistiu de quatro repetições contendo 8 lagartas cada. As avaliações quanto à mortalidade foram realizadas diariamente, durante 12 dias, sendo que os insetos mortos foram imersos em solução de álcool 70%, e em seguida em água destilada, e transferidos para câmara úmida, a fim de permitir o desenvolvimento do fungo e assim, a confirmação do agente causador da mortalidade. Análise estatística. Os dados foram transformados, quando necessário, e submetidos à análise de variância (teste F) e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey (P≤0,05), utilizando o programa Sisvar (Ferreira 1992). Para avaliação da correlação (ρ) foi utilizado o programa Microsoft Excel^®. Resultados e Discussão Produtos comerciais. Observou-se redução em todas as variáveis avaliadas nos tratamentos com produtos comerciais, sendo que diferiram da respectiva testemunha. Além disso, observou-se, através da análise de correlação, que o efeito destes produtos sobre a atividade do fungo está inversamente relacionado à concentração dos produtos (Tabela 2). Os produtos Agro-mos^® e Ecolife^® quando adicionados ao meio de cultura nas menores concentrações (0,25 e 0,5%) causaram reduções no crescimento vegetativo (Agro-mos^®: F = 970,52; gl = 5, 18; P < 0,05; Ecolife^®: F = 439,52; gl = 5, 18; P < 0,05), produção de conídios (Agro-mos^®: F = 275,05; gl = 5, 18; P < 0,05; Ecolife^®: F = 277,01; gl = 5, 18; P < 0,05) e germinação de conídios (Agro-mos^®: F = 143,18; gl = 5, 12; P < 0,05; Ecolife^®: F = 130,62; gl = 5, 12; P < 0,05), e nas maiores concentrações (1, 2 e 4%) ocasionaram inibição total do fungo (Tabela 2). O efeito negativo de Agro-mos^® provavelmente está associado à presença do cobre a 6% p/p em sua composição, o qual possui ação fungicida, uma vez que estudos realizados in vitro comprovaram que produtos fitossanitários à base de cobre foram muito tóxicos a B. bassiana (Tamai et al. 2002, Almeida et al. 2003). O produto Ecolife^® é composto por bioflavonóides, fitoalexinas cítricas, polifenóis e ácidos orgânicos. O efeito fungicida pode estar relacionado à ação das fitoalexinas, que são compostos antimicrobianos, sintetizados e armazenados nas plantas (Paxton 1981), cujo modo de ação sobre fungos envolve desorganização dos conteúdos citoplasmáticos, ruptura da membrana citoplasmática e inibição de enzimas fúngicas (Lo et al. 1996). Outro fator a ser considerado é o pH muito baixo do Ecolife^®, que na forma pura é 2,0 e quando misturado ao meio de cultura faz com que o pH deste passe de aproximadamente 7,0 para valores inferiores (5,6; 5,1; 4,8; 4,4 e 4, respectivamente, para as concentrações de 0,25; 0,5; 1; 2 e 4% do produto). Considerando que o pH ótimo para o desenvolvimento de B. bassiana está entre 5,0 e 8,0 (Hallsworth & Magan 1996), provavelmente este fator possa ter contribuído para a diminuição no desenvolvimento do fungo, à medida em que se aumentavam as concentrações do produto. Estudos semelhantes mostraram que o fungo Colletotrichum lagenarium Pass., causador da antracnose foi afetado em 70% do seu crescimento micelial, 96% da esporulação e 100% da germinação dos esporos pela presença de 0,5% de Ecolife^® no meio de cultura (Motoyama et al. 2003). Da mesma forma, observou-se o efeito deste produto sobre o crescimento micelial de Phoma costarricensis Ech. nas concentrações de 0,25 e 0,5%, e tal como aqui, ocorreu diminuição desta variável em 50 e 75%, respectivamente (Barguil et al. 2005). Em relação aos dados obtidos com o fungo produzido com o produto Dalneem^®, verificou-se que nas concentrações entre 0,25 e 2% foram obtidas colônias de mesmo tamanho, sendo em torno de 15 e 20%, menores que a testemunha, e na concentração 4%, o crescimento vegetativo foi 38% menor em relação ao controle (F = 13,39; gl = 5, 18; P < 0,05). Quanto à produção de conídios, houve redução gradativa entre os tratamentos, variando de 47% na menor a 93% na maior concentração, quando comparada à testemunha (F = 102,89; gl = 5, 18; P < 0,05). A germinação foi consideravelmente afetada pelo produto, havendo conídios viáveis apenas nas duas menores concentrações (0,25 e 0,5%), com redução de 85 e 92%, em relação à testemunha (F = 120,90; gl = 5, 12; P < 0,05). Quando adicionado ao meio de cultura nas concentrações de 2 e 4%, o produto Dalneem^® permitiu crescimento de colônia, mas não a germinação de conídios. Esse fato pode estar relacionado ao efeito fungistático do produto, o qual retardou a germinação dos conídios. Hirose et al. (2001), utilizando 2% de óleo de sementes de nim e B. bassiana, mostraram redução de 36,6% do crescimento vegetativo, 84,9% na produção de conídios e 25% de redução na germinação dos conídios. Da mesma forma, Marques et al. (2004) observaram que o produto NIM-I-GO^® (à base de o óleo de sementes de nim), em concentrações de 0,32 e 5%, inibiu a produção de conídios de B. bassiana em 88,6 e 96,6%, respectivamente, porém, ao contrário do observado, nenhuma das concentrações avaliadas afetou a germinação dos conídios. Os resultados apresentados por estes autores quanto ao crescimento vegetativo e produção de conídios foram semelhantes aos obtidos neste trabalho, porém houve grande divergência quanto à germinação dos conídios, sendo que tais autores observaram pouca influência dos produtos sobre a germinação e no presente trabalho a germinação foi muito afetada. Talvez esta divergência se deva às variações nos teores de azadirachtina nos diferentes produtos, sendo que ela possui ação fungitóxica (Sidhu et al. 2004) e não ocorre esta padronização nas formulações à base de nim (Brito et al. 2006). Outro fator que pode influenciar diferenças entre os trabalhos que visam estudar os efeitos dos produtos sobre fungos é falta de padronização na metodologia para a realização de testes de compatibilidade (Silva & Neves 2005). Neste sentido, pode-se citar a divergência dos resultados obtidos neste trabalho com os obtidos por Dipieri et al. (2005), os quais constataram que o produto Dalneem^®, nas concentrações 0,5 e 1%, reduziu em 49,8 e 53,1%, respectivamente o crescimento vegetativo do fungo, 49,8 e 66,3% a produção de conídios e não afetou a germinação. Esta discordância entre os resultados provavelmente ocorreu devido as diferentes metodologias adotadas para a realização dos testes. Para a inoculação do fungo nos meios de cultura contendo os tratamentos (para a avaliação de crescimento vegetativo e produção de conídios) os autores o fizeram por meio de micélios em discos de BDA, e para a avaliação da germinação dos conídios foram utilizadas lâminas microscópicas que continham uma camada de BDA e conídios, incubadas por 20 horas. Verificou-se também que nenhum dos produtos comerciais foi considerado compatível quanto à toxicidade a B. bassiana (Tabela 3). Os produtos Agro-mos^® e Ecolife^® foram classificados como muito tóxicos ao entomopatógeno, enquanto Dalneem^®, nas concentrações 0,25 e 0,5%, foi classificado como moderadamente tóxico e tóxico, respectivamente, e nas concentrações mais elevadas, muito tóxico. Porém, deve-se levar em consideração que os experimentos foram conduzidos expondo ao máximo o fungo à ação dos produtos, situação esta que não acontece em condições de campo, de forma que a alta toxicidade in vitro pode não se repetir no campo, mas mostra a possibilidade de ocorrência, sendo necessário realizar ensaios em tais condições (Alves et al. 1998a, Neves et al. 2001). Extratos não comerciais. Os extratos de cúrcuma, citronela e capim-limão, causaram redução em algumas das variáveis avaliadas de B. bassiana, porém, nenhuma das plantas inibiu totalmente o fungo, mesmo nas maiores concentrações (Tabela 4). O extrato de cúrcuma na concentração 1% inibiu o crescimento vegetativo em 19,6%, comparado à testemunha, não ocorrendo maiores alterações no tamanho de colônia ao se aumentar as quantidades do extrato, chegando ao máximo de 33% de inibição no tratamento 20% (F = 22,67; gl = 5, 18; P < 0,05). A produção de conídios não foi afetada com a concentração 1%, porém, nas demais foi consideravelmente reduzida, chegando a 90% de inibição no tratamento 20% (F = 100,76; gl = 5, 18; P < 0,05). A germinação dos conídios foi a variável mais afetada, observando-se diminuição de 50% na concentração mais baixa da planta e 90% na maior, se comparado com o controle (F = 82,08; gl = 5, 12; P < 0,05). A cúrcuma possui ação comprovada contra vários fungos fitopatogênicos (Saju et al. 1998, Singh et al. 2002), que são consideravelmente afetados em algumas variáveis, como o crescimento vegetativo, sendo os efeitos mais severos em relação aos observados no presente trabalho. Ressalta-se, porém, que desconhecerem-se relatos sobre o efeito desta planta sobre fungos entomopatogênicos. Contudo, estudos realizados mostraram que 10% do rizoma em meio de cultura provoca a redução de 70% do crescimento vegetativo do fungo Helminthosporium oryzae Breda de Hann, bem como 1% de extrato inibe 61% do crescimento vegetativo de Fusarium oxysporum Schltdl. e Rhizoctonia solani Kuhn, sendo todos fungos fitopatogênicos pertencentes à mesma classe que B. bassiana, Hyphomycetes, o que, de certa forma, pode corroborar com os resultados aqui obtidos (Harish et al. 2004, Amaral & Bara 2005). Quanto ao capim-limão, sua ação reduziu em 20 e 37% o crescimento vegetativo nas concentrações 1 e 20%, respectivamente, se comparada à testemunha (F = 42,99; gl = 5, 18; P < 0,05). O extrato da planta, nas concentrações entre 1 a 15%, não afetou a produção de conídios, ocorrendo diminuição apenas na maior concentração (93% de redução) (F = 15,29; gl = 5, 18; P < 0,05). Em relação à viabilidade, verificou-se na concentração de 1% uma redução de 66% em relação à testemunha, sendo que entre nos tratamento 5 e 20% a germinação foi reduzida em 76 e 95%, respectivamente, em comparação ao controle (F = 60,05; gl = 5, 12; P < 0,05). Os estudos relacionados às atividades de capim-limão revelam atividade bactericida (Cimanga et al. 2002, Ordóñes et al. 2004), repelente a insetos (Oyedele et al. 2002), inseticida (Cavalcanti et al. 2004) e fungicida para fungos fitopatogênicos (Paranagama et al. 2003, Herath & Abeywickrama 2008), sendo que na maioria utilizou-se o óleo essencial da planta para a realização dos testes, e assim como a cúrcuma, são escassos os estudos sobre a atividade da planta sobre fungos entomopatogênicos. Porém, ao comparar os resultados obtidos por Fiori et al. (2000) ao avaliar os efeitos de extrato bruto de capim-limão sobre o fungo Didymella bryoniae Auersw. Rehm, causador de doenças em cultivo de melão, observou-se que este patógeno é menos suscetível ao extrato de capim-limão que B. bassiana, já que a concentração 20% inibiu apenas 31% a produção de conídios do fitopatógeno, apesar de ambos pertencerem ao mesmo grupo Deuteromycota. Em relação à citronela, houve redução de 25,8% no crescimento vegetativo no meio contendo 1% e 10% do seu extrato, em relação à testemunha. Contudo, a diferença não foi verificada na concentração de 5%. Nas outras concentrações, o crescimento foi afetado, com redução de 23 a 53% em relação à testemunha (F = 101,07; gl = 5, 18; P < 0,05). A produção de conídios aumentou 42% no tratamento 1%, em relação ao controle, além disso, as concentrações 5 e 10% não inibiram a produção de conídios, havendo efeito negativo somente nas concentrações 15 e 20% (F = 116,18; gl = 5, 18; P < 0,05). Quanto à germinação, no tratamento 1% houve uma queda de 52% comparando-se ao controle, mas não houve diferença significativa entre as demais concentrações, já que a redução permaneceu em torno de 75% (F = 148,32; gl = 5, 12; P < 0,05). O aumento da produção de conídios quando adicionado o extrato bruto da citronela na concentração 1% pode ter ocorrido pelo aproveitamento de algum componente da planta, que em determinada quantidade pode ser metabolizado como nutriente pelo fungo, conforme observaram Tamai et al. (2002), testando in vitro o efeito de alguns produtos fitossanitários sintéticos sobre B. bassiana. Além disso, Billerbeck et al. (2001) constataram que o óleo essencial de citronela é capaz de interferir a função das enzimas responsáveis por sintetizar células estruturais do fungo Aspergillus niger V. Tieg. (pertencente ao mesmo grupo Deuteromycota de B. bassiana), o que ocasionou distúrbios no seu crescimento. No entanto, pouco se sabe sobre o seu efeito sobre organismos não-alvo, como os fungos entomopatogênicos. Observou-se também, que todos os extratos, nas menores concentrações foram compatíveis ao fungo, contudo, todos foram muito tóxicos ao fungo na maior concentração (Tabela 5). O estímulo na produção de conídios pela citronela nas duas menores concentrações, e a atribuição de 80% do valor da fórmula para esta variável, resultaram em valores de T acima de 100, explicando assim a compatibilidade com o fungo. Tal como mencionado para os produtos comerciais, a ocorrência de compatibilidade em experimentos in vitro, nos quais extratos de planta e fungo foram expostos ao máximo de contato, garantem a mesma relação em campo, onde o contato entre eles é menor. Por outro lado, a incompatibilidade in vitro pode não se repetir em condições de campo (Alves et al. 1998a). Ao se comparar os efeitos dos produtos e das plantas sobre B. bassiana pelo cálculo de toxicidade, nota-se que, de modo geral, as plantas foram menos tóxicas ao fungo que os produtos comerciais, já que estes não apresentaram compatibilidade. Possivelmente este fato tenha ocorrido devido à maior concentração de diferentes princípios ativos ou presença de certos ingredientes das formulações comerciais, como estabilizantes e emulsificantes, que podem afetar o entomopatógeno (Batista et al. 1998). Neste sentido, estudos comprovaram que quantidades iguais de diferentes formulações de sementes de nim diferem quanto à compatibilidade a B. bassiana (Dipieri et al. 2005). Em outro trabalho, Tamai et al. (2002) observaram que inseticidas sintéticos de diferentes fabricantes, com a mesma composição de ingredientes ativos, levaram a diferença na toxicidade para B. bassiana, fato que, segundo os autores, não se deve à concentração do princípio ativo, mas sim a outros constituintes de cada formulação. Outra questão que deve ser considerada é o fato da fórmula de toxicidade não levar em conta a germinação, atribuindo valores apenas para a produção de conídios e crescimento vegetativo. Apesar de o crescimento vegetativo ser importante para a colonização do hospedeiro e a produção de conídios ser responsável pela transmissão vertical do fungo (Alves et al. 1998a), a germinação deve ser igualmente considerada, já que havendo inibição da germinação dos conídios (como no caso dos produtos comerciais), conclui-se que o fungo afetado não irá penetrar no inseto, não ocorrendo o desenvolvimento da doença, o que evidencia a necessidade de revisão do cálculo para que passe a levar em consideração tal variável. Em relação ao teste de patogenicidade, constatou-se que os tratamentos considerados compatíveis à B. bassiana não afetaram a atividade do fungo (F = 18,23; gl = 9, 30; P < 0,05) (Tabela 6). Observou-se que os tratamentos compatíveis causaram pequena redução no crescimento vegetativo do fungo, sem afetar a produção de conídios e a atividade inseticida, havendo ainda estímulo para a primeira, nos tratamentos com citronela 1 e 5%. Tais extratos de plantas, quando em contato máximo com o fungo, apresentaram em laboratório um efeito desejável em campo, a maximização da sua conidiogênese, sem redução da sua eficiência no controle de insetos. Com isso, mais estudos devem ser realizados relacionando os extratos de plantas e B. bassiana, principalmente com os de citronela, a fim de garantir se estes causam os mesmos efeitos observados em diferentes condições de contato com o fungo. Além disso, deve-se levar em consideração a importância da realização de experimentos que reproduzam ao máximo as condições de campo, pois só desta forma é que se pode observar o real efeito dos produtos ou plantas sobre os inimigos naturais. Agradecimentos Aos professores da Universidade Estadual do Oeste do Paraná, José R. Stangarlin pelo material e metodologia cedidos, e Fabiana G. S. Pinto pela colaboração no desenvolvimento do trabalho. Literatura Citada Agrianual. 2001. Anuário da agricultura brasileira. 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O fungo utilizado foi o isolado Unioeste 4 de B. bassiana (isolado de Alphitobius diaperinus Panzer, Coleoptera: Tenebrionidae), obtido no banco de patógenos do Laboratório de Zoologia de Invertebrados da UNIOESTE, cultivado pelo método de placa cheia em meio de esporulação (M.E.) e incubado por oito dias em câmara climatizada (26 ± 1°Ce 12h de fotofase) (Alves et al. 1998b). Após este período, o fungo foi recolhido e transferido para um tubo de vidro, onde se adicionaram 10 mL de água destilada estéril com espalhante adesivo Tween^® 80 (0,01%) para que fosse realizada a quantificação em câmara de Neubauer e padronização da concentração de conídios (Alves & Moraes 1998).

Os tratamentos com as diferentes concentrações de produtos comerciais e extratos de plantas, utilizados como indutores de crescimento, inseticidas, fungicidas e/ou repelentes naturais estão expressos na Tabela 1.

Preparação dos meios de cultura. Os produtos comerciais foram adicionados em diferentes proporções (0,25; 0,5; 1; 2 e 4%) ao meio de cultura BDA (batata, ágar e dextrose) estéril não solidificado (45-50ºC), em frascos de vidro, sendo agitados para homogeneização dos componentes. Em seguida, adicionou-se o antibiótico sulfato de estreptomicina (0,1%) e então os meios foram vertidos nas placas de Petri. Cada tratamento constou de quatro repetições, contendo uma placa cada repetição.

As folhas das diferentes plantas foram trituradas juntamente com o caldo de batata, na quantidade em gramas necessária para se obter as diferentes concentrações (1; 5; 10; 15; e 20%). O líquido foi filtrado e a ele adicionaram-se a glicose e o ágar, que foram homogeneizados e, em seguida, esterilizados. Posteriormente, adicionou-se sulfato de estreptomicina (0,1%) e verteu-se o meio, como descrito anteriormente. Para a testemunha foram preparadas placas de Petri contendo apenas meio de cultura BDA.

Crescimento vegetativo e produção de conídios. Em todos os tratamentos realizou-se o mesmo procedimento, sendo inoculados, no centro de cada placa, 50µL de suspensão contendo 5×10⁷ conídios de B. bassiana. As placas foram incubadas a 26 ± 1^oC e 12 h de fotofase, por oito dias. Para a avaliação de crescimento vegetativo foram realizadas duas medições perpendiculares na área onde o fungo cresceu, obtendo-se o diâmetro médio das colônias dos tratamentos. Para a estimativa da produção de conídios, as colônias foram recortadas e cada uma foi transferida para um tubo de vidro contendo 10 mL de água destilada esterilizada com espalhante adesivo Tween^® 80 (0,01%). Os conídios foram removidos por agitação durante 1 minuto. A suspensão obtida foi subseqüentemente diluída e quantificada em câmara de Neubauer.

Os dados obtidos nas avaliações destes parâmetros foram submetidos ao cálculo compatibilidade, de acordo com a fórmula proposta por Alves et al. (1998a) para classificação do efeito de produtos químicos sobre fungos entomopatogênicos em testes in vitro, onde:

VG = crescimento vegetativo e ESP = esporulação. Para valores de T entre 0 e 30, a classificação é muito tóxico; entre 31 a 45, tóxico; 46 a 60, moderadamente tóxico e maiores que 60, compatível.

Germinação de conídios. O meio com os diferentes tratamentos foi vertido em placas de plástico de 9 cm de diâmetro e, depois do resfriamento e solidificação, foram espalhados 50µL de suspensão fúngica contendo 5×10⁷ conídios, pelo método de placa cheia. As placas foram incubadas por 16h a 26 ± 1^oC e 12 h de fotofase. Após este período, contou-se, dentre 500 conídios por placa, o número de conídios germinados e não-germinados, sob microscópio óptico (400×).

Teste de patogenicidade. Para este teste, utilizaram-se apenas os tratamentos que foram considerados compatíveis com o fungo pelo cálculo de compatibilidade. Conídios do fungo foram inoculados pelo método de placa cheia nas placas de Petri contendo o meio BDA com os tratamentos. Após oito dias de incubação (a 26 ± 1^oC e 12 h de fotofase), os conídios foram recolhidos e transferidos para tubos de vidro contendo 10 mL de água destilada esterilizada com espalhante adesivo Tween^® 80 (0,01%). As suspensões obtidas foram homogeneizadas, diluídas, quantificadas em câmara de Neubauer, e padronizadas em concentrações de 1×10⁸ conídios/mL.

Lagartas de 5^o ínstar de Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Pyralidae) foram utilizadas como inseto-teste, colocadas em recipientes plásticos descartáveis onde foram imersas em 1 mL de suspensão de conídios, sendo agitados manualmente por 30 segundos. Na testemunha, as lagartas foram imersas em solução aquosa de espalhante adesivo Tween^® 80 (0,01%). Em seguida, os insetos foram transferidos para placas de Petri contendo papel filtro e dieta. As placas foram colocadas em recipientes plásticos contendo algodão umedecido, e estes mantidos em 26 ± 1°C e 14h de fotofase. Cada tratamento consistiu de quatro repetições contendo 8 lagartas cada. As avaliações quanto à mortalidade foram realizadas diariamente, durante 12 dias, sendo que os insetos mortos foram imersos em solução de álcool 70%, e em seguida em água destilada, e transferidos para câmara úmida, a fim de permitir o desenvolvimento do fungo e assim, a confirmação do agente causador da mortalidade.

Análise estatística. Os dados foram transformados, quando necessário, e submetidos à análise de variância (teste F) e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey (P≤0,05), utilizando o programa Sisvar (Ferreira 1992). Para avaliação da correlação (ρ) foi utilizado o programa Microsoft Excel^®.

Resultados e Discussão

Produtos comerciais. Observou-se redução em todas as variáveis avaliadas nos tratamentos com produtos comerciais, sendo que diferiram da respectiva testemunha. Além disso, observou-se, através da análise de correlação, que o efeito destes produtos sobre a atividade do fungo está inversamente relacionado à concentração dos produtos (Tabela 2).

Os produtos Agro-mos^® e Ecolife^® quando adicionados ao meio de cultura nas menores concentrações (0,25 e 0,5%) causaram reduções no crescimento vegetativo (Agro-mos^®: F = 970,52; gl = 5, 18; P < 0,05; Ecolife^®: F = 439,52; gl = 5, 18; P < 0,05), produção de conídios (Agro-mos^®: F = 275,05; gl = 5, 18; P < 0,05; Ecolife^®: F = 277,01; gl = 5, 18; P < 0,05) e germinação de conídios (Agro-mos^®: F = 143,18; gl = 5, 12; P < 0,05; Ecolife^®: F = 130,62; gl = 5, 12; P < 0,05), e nas maiores concentrações (1, 2 e 4%) ocasionaram inibição total do fungo (Tabela 2).

O efeito negativo de Agro-mos^® provavelmente está associado à presença do cobre a 6% p/p em sua composição, o qual possui ação fungicida, uma vez que estudos realizados in vitro comprovaram que produtos fitossanitários à base de cobre foram muito tóxicos a B. bassiana (Tamai et al. 2002, Almeida et al. 2003).

O produto Ecolife^® é composto por bioflavonóides, fitoalexinas cítricas, polifenóis e ácidos orgânicos. O efeito fungicida pode estar relacionado à ação das fitoalexinas, que são compostos antimicrobianos, sintetizados e armazenados nas plantas (Paxton 1981), cujo modo de ação sobre fungos envolve desorganização dos conteúdos citoplasmáticos, ruptura da membrana citoplasmática e inibição de enzimas fúngicas (Lo et al. 1996).

Outro fator a ser considerado é o pH muito baixo do Ecolife^®, que na forma pura é 2,0 e quando misturado ao meio de cultura faz com que o pH deste passe de aproximadamente 7,0 para valores inferiores (5,6; 5,1; 4,8; 4,4 e 4, respectivamente, para as concentrações de 0,25; 0,5; 1; 2 e 4% do produto). Considerando que o pH ótimo para o desenvolvimento de B. bassiana está entre 5,0 e 8,0 (Hallsworth & Magan 1996), provavelmente este fator possa ter contribuído para a diminuição no desenvolvimento do fungo, à medida em que se aumentavam as concentrações do produto.

Estudos semelhantes mostraram que o fungo Colletotrichum lagenarium Pass., causador da antracnose foi afetado em 70% do seu crescimento micelial, 96% da esporulação e 100% da germinação dos esporos pela presença de 0,5% de Ecolife^® no meio de cultura (Motoyama et al. 2003).

Da mesma forma, observou-se o efeito deste produto sobre o crescimento micelial de Phoma costarricensis Ech. nas concentrações de 0,25 e 0,5%, e tal como aqui, ocorreu diminuição desta variável em 50 e 75%, respectivamente (Barguil et al. 2005).

Em relação aos dados obtidos com o fungo produzido com o produto Dalneem^®, verificou-se que nas concentrações entre 0,25 e 2% foram obtidas colônias de mesmo tamanho, sendo em torno de 15 e 20%, menores que a testemunha, e na concentração 4%, o crescimento vegetativo foi 38% menor em relação ao controle (F = 13,39; gl = 5, 18; P < 0,05). Quanto à produção de conídios, houve redução gradativa entre os tratamentos, variando de 47% na menor a 93% na maior concentração, quando comparada à testemunha (F = 102,89; gl = 5, 18; P < 0,05). A germinação foi consideravelmente afetada pelo produto, havendo conídios viáveis apenas nas duas menores concentrações (0,25 e 0,5%), com redução de 85 e 92%, em relação à testemunha (F = 120,90; gl = 5, 12; P < 0,05).

Quando adicionado ao meio de cultura nas concentrações de 2 e 4%, o produto Dalneem^® permitiu crescimento de colônia, mas não a germinação de conídios. Esse fato pode estar relacionado ao efeito fungistático do produto, o qual retardou a germinação dos conídios.

Hirose et al. (2001), utilizando 2% de óleo de sementes de nim e B. bassiana, mostraram redução de 36,6% do crescimento vegetativo, 84,9% na produção de conídios e 25% de redução na germinação dos conídios. Da mesma forma, Marques et al. (2004) observaram que o produto NIM-I-GO^® (à base de o óleo de sementes de nim), em concentrações de 0,32 e 5%, inibiu a produção de conídios de B. bassiana em 88,6 e 96,6%, respectivamente, porém, ao contrário do observado, nenhuma das concentrações avaliadas afetou a germinação dos conídios.

Os resultados apresentados por estes autores quanto ao crescimento vegetativo e produção de conídios foram semelhantes aos obtidos neste trabalho, porém houve grande divergência quanto à germinação dos conídios, sendo que tais autores observaram pouca influência dos produtos sobre a germinação e no presente trabalho a germinação foi muito afetada. Talvez esta divergência se deva às variações nos teores de azadirachtina nos diferentes produtos, sendo que ela possui ação fungitóxica (Sidhu et al. 2004) e não ocorre esta padronização nas formulações à base de nim (Brito et al. 2006).

Outro fator que pode influenciar diferenças entre os trabalhos que visam estudar os efeitos dos produtos sobre fungos é falta de padronização na metodologia para a realização de testes de compatibilidade (Silva & Neves 2005).

Neste sentido, pode-se citar a divergência dos resultados obtidos neste trabalho com os obtidos por Dipieri et al. (2005), os quais constataram que o produto Dalneem^®, nas concentrações 0,5 e 1%, reduziu em 49,8 e 53,1%, respectivamente o crescimento vegetativo do fungo, 49,8 e 66,3% a produção de conídios e não afetou a germinação. Esta discordância entre os resultados provavelmente ocorreu devido as diferentes metodologias adotadas para a realização dos testes. Para a inoculação do fungo nos meios de cultura contendo os tratamentos (para a avaliação de crescimento vegetativo e produção de conídios) os autores o fizeram por meio de micélios em discos de BDA, e para a avaliação da germinação dos conídios foram utilizadas lâminas microscópicas que continham uma camada de BDA e conídios, incubadas por 20 horas.

Verificou-se também que nenhum dos produtos comerciais foi considerado compatível quanto à toxicidade a B. bassiana (Tabela 3).

Os produtos Agro-mos^® e Ecolife^® foram classificados como muito tóxicos ao entomopatógeno, enquanto Dalneem^®, nas concentrações 0,25 e 0,5%, foi classificado como moderadamente tóxico e tóxico, respectivamente, e nas concentrações mais elevadas, muito tóxico.

Porém, deve-se levar em consideração que os experimentos foram conduzidos expondo ao máximo o fungo à ação dos produtos, situação esta que não acontece em condições de campo, de forma que a alta toxicidade in vitro pode não se repetir no campo, mas mostra a possibilidade de ocorrência, sendo necessário realizar ensaios em tais condições (Alves et al. 1998a, Neves et al. 2001).

Extratos não comerciais. Os extratos de cúrcuma, citronela e capim-limão, causaram redução em algumas das variáveis avaliadas de B. bassiana, porém, nenhuma das plantas inibiu totalmente o fungo, mesmo nas maiores concentrações (Tabela 4).

Tabela4

O extrato de cúrcuma na concentração 1% inibiu o crescimento vegetativo em 19,6%, comparado à testemunha, não ocorrendo maiores alterações no tamanho de colônia ao se aumentar as quantidades do extrato, chegando ao máximo de 33% de inibição no tratamento 20% (F = 22,67; gl = 5, 18; P < 0,05). A produção de conídios não foi afetada com a concentração 1%, porém, nas demais foi consideravelmente reduzida, chegando a 90% de inibição no tratamento 20% (F = 100,76; gl = 5, 18; P < 0,05). A germinação dos conídios foi a variável mais afetada, observando-se diminuição de 50% na concentração mais baixa da planta e 90% na maior, se comparado com o controle (F = 82,08; gl = 5, 12; P < 0,05).

A cúrcuma possui ação comprovada contra vários fungos fitopatogênicos (Saju et al. 1998, Singh et al. 2002), que são consideravelmente afetados em algumas variáveis, como o crescimento vegetativo, sendo os efeitos mais severos em relação aos observados no presente trabalho. Ressalta-se, porém, que desconhecerem-se relatos sobre o efeito desta planta sobre fungos entomopatogênicos.

Contudo, estudos realizados mostraram que 10% do rizoma em meio de cultura provoca a redução de 70% do crescimento vegetativo do fungo Helminthosporium oryzae Breda de Hann, bem como 1% de extrato inibe 61% do crescimento vegetativo de Fusarium oxysporum Schltdl. e Rhizoctonia solani Kuhn, sendo todos fungos fitopatogênicos pertencentes à mesma classe que B. bassiana, Hyphomycetes, o que, de certa forma, pode corroborar com os resultados aqui obtidos (Harish et al. 2004, Amaral & Bara 2005).

Quanto ao capim-limão, sua ação reduziu em 20 e 37% o crescimento vegetativo nas concentrações 1 e 20%, respectivamente, se comparada à testemunha (F = 42,99; gl = 5, 18; P < 0,05). O extrato da planta, nas concentrações entre 1 a 15%, não afetou a produção de conídios, ocorrendo diminuição apenas na maior concentração (93% de redução) (F = 15,29; gl = 5, 18; P < 0,05). Em relação à viabilidade, verificou-se na concentração de 1% uma redução de 66% em relação à testemunha, sendo que entre nos tratamento 5 e 20% a germinação foi reduzida em 76 e 95%, respectivamente, em comparação ao controle (F = 60,05; gl = 5, 12; P < 0,05).

Os estudos relacionados às atividades de capim-limão revelam atividade bactericida (Cimanga et al. 2002, Ordóñes et al. 2004), repelente a insetos (Oyedele et al. 2002), inseticida (Cavalcanti et al. 2004) e fungicida para fungos fitopatogênicos (Paranagama et al. 2003, Herath & Abeywickrama 2008), sendo que na maioria utilizou-se o óleo essencial da planta para a realização dos testes, e assim como a cúrcuma, são escassos os estudos sobre a atividade da planta sobre fungos entomopatogênicos.

Porém, ao comparar os resultados obtidos por Fiori et al. (2000) ao avaliar os efeitos de extrato bruto de capim-limão sobre o fungo Didymella bryoniae Auersw. Rehm, causador de doenças em cultivo de melão, observou-se que este patógeno é menos suscetível ao extrato de capim-limão que B. bassiana, já que a concentração 20% inibiu apenas 31% a produção de conídios do fitopatógeno, apesar de ambos pertencerem ao mesmo grupo Deuteromycota.

Em relação à citronela, houve redução de 25,8% no crescimento vegetativo no meio contendo 1% e 10% do seu extrato, em relação à testemunha. Contudo, a diferença não foi verificada na concentração de 5%. Nas outras concentrações, o crescimento foi afetado, com redução de 23 a 53% em relação à testemunha (F = 101,07; gl = 5, 18; P < 0,05). A produção de conídios aumentou 42% no tratamento 1%, em relação ao controle, além disso, as concentrações 5 e 10% não inibiram a produção de conídios, havendo efeito negativo somente nas concentrações 15 e 20% (F = 116,18; gl = 5, 18; P < 0,05). Quanto à germinação, no tratamento 1% houve uma queda de 52% comparando-se ao controle, mas não houve diferença significativa entre as demais concentrações, já que a redução permaneceu em torno de 75% (F = 148,32; gl = 5, 12; P < 0,05).

O aumento da produção de conídios quando adicionado o extrato bruto da citronela na concentração 1% pode ter ocorrido pelo aproveitamento de algum componente da planta, que em determinada quantidade pode ser metabolizado como nutriente pelo fungo, conforme observaram Tamai et al. (2002), testando in vitro o efeito de alguns produtos fitossanitários sintéticos sobre B. bassiana.

Além disso, Billerbeck et al. (2001) constataram que o óleo essencial de citronela é capaz de interferir a função das enzimas responsáveis por sintetizar células estruturais do fungo Aspergillus niger V. Tieg. (pertencente ao mesmo grupo Deuteromycota de B. bassiana), o que ocasionou distúrbios no seu crescimento. No entanto, pouco se sabe sobre o seu efeito sobre organismos não-alvo, como os fungos entomopatogênicos.

Observou-se também, que todos os extratos, nas menores concentrações foram compatíveis ao fungo, contudo, todos foram muito tóxicos ao fungo na maior concentração (Tabela 5).

O estímulo na produção de conídios pela citronela nas duas menores concentrações, e a atribuição de 80% do valor da fórmula para esta variável, resultaram em valores de T acima de 100, explicando assim a compatibilidade com o fungo.

Tal como mencionado para os produtos comerciais, a ocorrência de compatibilidade em experimentos in vitro, nos quais extratos de planta e fungo foram expostos ao máximo de contato, garantem a mesma relação em campo, onde o contato entre eles é menor. Por outro lado, a incompatibilidade in vitro pode não se repetir em condições de campo (Alves et al. 1998a).

Ao se comparar os efeitos dos produtos e das plantas sobre B. bassiana pelo cálculo de toxicidade, nota-se que, de modo geral, as plantas foram menos tóxicas ao fungo que os produtos comerciais, já que estes não apresentaram compatibilidade. Possivelmente este fato tenha ocorrido devido à maior concentração de diferentes princípios ativos ou presença de certos ingredientes das formulações comerciais, como estabilizantes e emulsificantes, que podem afetar o entomopatógeno (Batista et al. 1998).

Neste sentido, estudos comprovaram que quantidades iguais de diferentes formulações de sementes de nim diferem quanto à compatibilidade a B. bassiana (Dipieri et al. 2005). Em outro trabalho, Tamai et al. (2002) observaram que inseticidas sintéticos de diferentes fabricantes, com a mesma composição de ingredientes ativos, levaram a diferença na toxicidade para B. bassiana, fato que, segundo os autores, não se deve à concentração do princípio ativo, mas sim a outros constituintes de cada formulação.

Outra questão que deve ser considerada é o fato da fórmula de toxicidade não levar em conta a germinação, atribuindo valores apenas para a produção de conídios e crescimento vegetativo. Apesar de o crescimento vegetativo ser importante para a colonização do hospedeiro e a produção de conídios ser responsável pela transmissão vertical do fungo (Alves et al. 1998a), a germinação deve ser igualmente considerada, já que havendo inibição da germinação dos conídios (como no caso dos produtos comerciais), conclui-se que o fungo afetado não irá penetrar no inseto, não ocorrendo o desenvolvimento da doença, o que evidencia a necessidade de revisão do cálculo para que passe a levar em consideração tal variável.

Em relação ao teste de patogenicidade, constatou-se que os tratamentos considerados compatíveis à B. bassiana não afetaram a atividade do fungo (F = 18,23; gl = 9, 30; P < 0,05) (Tabela 6).

Observou-se que os tratamentos compatíveis causaram pequena redução no crescimento vegetativo do fungo, sem afetar a produção de conídios e a atividade inseticida, havendo ainda estímulo para a primeira, nos tratamentos com citronela 1 e 5%. Tais extratos de plantas, quando em contato máximo com o fungo, apresentaram em laboratório um efeito desejável em campo, a maximização da sua conidiogênese, sem redução da sua eficiência no controle de insetos.

Com isso, mais estudos devem ser realizados relacionando os extratos de plantas e B. bassiana, principalmente com os de citronela, a fim de garantir se estes causam os mesmos efeitos observados em diferentes condições de contato com o fungo. Além disso, deve-se levar em consideração a importância da realização de experimentos que reproduzam ao máximo as condições de campo, pois só desta forma é que se pode observar o real efeito dos produtos ou plantas sobre os inimigos naturais.

Agradecimentos

Aos professores da Universidade Estadual do Oeste do Paraná, José R. Stangarlin pelo material e metodologia cedidos, e Fabiana G. S. Pinto pela colaboração no desenvolvimento do trabalho.

Literatura Citada

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